МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Бактериологические исследования

с использованием комплектов питательных сред

«НоваСтрик» в практической работе

бактериологических лабораторий

Методические рекомендации

 

Методические рекомендации «Бактериологические исследования с использованием комплектов питательных сред «НоваСтрик» в практической работе бактериологических лабораторий»

  1. Разработаны Федеральным центром Госсанэпиднадзора Минздрава России (Брагина И. В., Кривопалова Н. С, Белобородова О. К.), Центром Госсанэпиднадзора в Ростовской области (Соловьев М. Ю., Митрофанова Т. В.), фирмой ЗАО «ДАС», Россия (Леонов О. В.).
  2. Утверждены и введены в действие Заместителем Главного государственного врача Российской Федерации - главным врачом Федерального центра Госсанэпиднадзора Минздрава России Е. Н. Беляевым
  3. Введены впервые.

Бактериологические исследования с использованием комплектов питательных сред «НоваСтрик» в практической работе бактериологических лабораторий

Методические рекомендации

1. Общие положения и область применения.

1.1
Настоящие методические рекомендации устанавливают методику проведения лабораторных исследований (испытаний) по определению качественного и количественного микробного загрязнения пищевых (в т.ч. молочных) продуктов и рабочих поверхностей с применением комплектов питательных сред «НоваСтрик» производства «NovaMed Ltd.» (Израиль).
1.2
Методические рекомендации разработаны в соответствии с федеральным законом ФЗ-52 «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» от 30.03.1999 г., Положением о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании, утвержденное Постановлением Правительства Российской Федерации от 24.07.2000 г. № 554, Положением о Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 30.07.04 № 322.
1.3
Методические рекомендации предназначены для применения в лабораториях организаций, независимо от форм собственности (далее - организации), осуществляющих производственный контроль качества при разработке, постановке на производство и в процессе выпуска пищевых (в т.ч. молочных продуктов), в лабораториях учреждений государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации и санитарно-эпидемиологических служб федеральных органов исполнительной власти, а также в лабораториях других организаций, аккредитованных в установленном порядке на право проведения испытаний указанных объектов.

2. Нормативные ссылки.

2.1 Федеральный закон «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» № 52-ФЗ от 30.03.1999г.
2.2 Закон РФ «О защите прав потребителей» от 07.02.1992 г.
2.3 Закон РФ «О качестве и безопасности пищевых продуктов» №29-ФЗ от 02.01.2000 г.
2.4 Регистрационное удостоверение Минздрава России П№ 015239/01 от 03.09.2003.
2.5 Нормативные документы НД 42-12-894-03, НД 4212895-03.
2.6
Инструкция по применению, утвержденная Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенко 27.08.2003.
2.7 СП 1.2.731-99 Безопасность работы с микроорганизмами Ш-IV групп патогенности и гельминтами.
2.8 ГОСТ 26668-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Порядок отбора проб для микробиологических анализов».
2.9 ГОСТ 26669-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов».
2.10 ГОСТ 26670-91 «Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов».
2.11 ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96) «Микробиология. Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований».
2.12
ГОСТ 10444.1-84 Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе.
2.13 ГОСТ 19569-89 Стерилизаторы паровые медицинские. Общие технические требования и методы испытаний.
2.14 ГОСТ 24104-88 Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия.
2.15 ГОСТ 29227-91 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования.
2.16 ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия.
2.17 ГОСТ 13805-76 Пептон сухой ферментативный.

3. Требования к помещениям и технике безопасности

3.1
Требования безопасности, общее расположение лаборатории, а также ее инфраструктура должны удовлетворять требованиям СП 1.2.731, ГОСТ Р 51446.
3.2
Лаборатория должна иметь санитарно-эпидемиологическое заключение и лицензию на работу с микроорганизмами Ш-IV групп патогенности.

4. Аппаратура, материалы, реактивы, контрольные штаммы

4.1 Термостат электрический, с диапазоном измерения от 15 °С до 65 °С, с отклонением от заданной ±1°С.
4.2 Стерилизатор паровой медицинский.
4.3 Весы лабораторные, необходимого диапазона и класса точности, для взвешивания анализируемых образцов.
4.4 Гомогенизатор бактериологический.
4.5 Стерильная лабораторная посуда.
4.6 Пипетки градуированные, калиброванные, 01 мл.
4.7 Штатив для транспортировки и инкубации.
4.8 Облучатель бактерицидный настенный.
4.9 Контрольные штаммы (ГИСК им. Л. А. Тарасевича): E.coli 25922, S.tyhpimurium 14028, S.aureus 25923, C.albicans 26790, Sh.flexneri 12022.
Допускается использование импортного оборудования зарубежного производства аналогичного назначения.

5. Питательные среды

5.1
Агар VRBA - предназначен для выделения и дифференциации энтеробактерий по тесту расщепления лактозы.
 
Состав: панкреатический гидролизат желатина, экстракт дрожжей, смесь солей желчи, лактоза, кальция хлорид, агар, нейтральный красный, кристаллический фиолетовый.
5.2
Агар Baird Parker - предназначен для выделения и культивирования стафилококков, (ингибирует энтеробактерий, грибы).
 
Состав: панкреатический гидролизат казеина, мясной экстракт, экстракт дрожжей, хлорид лития, глицин, кальция пируват, агар.
5.3
Агар РСА - предназначен для выделения и культивирования большинства видов бактерий и грибов.
 
Состав: панкреатический гидролизат казеина, экстракт дрожжей, декстроза, агар.
5.4
Salmonella ID Agar - представляет собой селективную питательную среду для обнаружения, прямой идентификации сальмонелл, а так же дифференциации их от других видов семейства Enterobacteriaceae. Основой среды служит двойная хромогенная система, позволяющая по цвету колоний различать микроорганизмы, проявляющие галактозидазную активность: а - (сальмонеллы) и Р -(другие представители энтеробактерий).
  Состав – конфиденциальная информация разработчика, конечный рН 7,2±0,2 (при 25 °С).
5.5
XLD Agar - представляет собой дифференциально-диагностическую среду предназначенную для выявления и дифференциации энтеропатогенных бактерий в продуктах питания. Дифференциация сальмонелл и шигелл от непатогенных энтеробактерий основана на трех видах биохимической реакции: ферментации ксилозы, декарбоксилации лизина и продукции сероводорода.
  Состав: г/л: -ксилоза - 3,5; L-лизин - 5,0; лактоза - 7,5; сахароза - 7,5; хлорид натрия - 5,0; дрожжевой экстракт - 3,0; феноловый красный - 0,08; де-зоксихолат натрия — 2,5; тиосульфат натрия - 6,8; цитрат аммония железа- 0,8; агар - 13,5; конечный рН 7,5±0,2 (при 25°С).

6. Методы отбора проб

Отбор проб проводят в соответствии с ГОСТ 26668 и другими действующими ГОСТ и НД на анализируемый вид продукции.

7. Подготовка проб

Подготовку проб проводят в соответствии с ГОСТ 26669 и другими действующими ГОСТ и НТД на анализируемый вид продукции.

Исходное разведение исследуемого образца и при необходимости ряд десятикратных разведений проводят в соответствии с ГОСТ 26669 стерильной дистиллированной водой или 0.1% пептонной водой, приготовленной по ГОСТ 10444.1.

Жидкие образцы можно не разводить.

Твердые образцы измельчают в гомогенизаторе.

8. Порядок проведения испытания

Техника использования тест-системы НоваСтрик меняется в зависимости от характера и свойств исследуемого материала.

Молоко, жидкие и полужидкие молочные и кисломолочные продукты без предварительного разведения проб или пищевые и молочные продукты твёрдой консистенции (колбасы, сыры, масло, маргарин и т.д.) после предварительного размельчения и разведения проб стерильной водой в соотношении 1:1 или 1:10;

Сырые, охлажденные и замороженные продукты ( мясо, мясопродукты, птица, рыба, продукты моря, полуфабрикаты, овощи, фрукты, сиропы и пасты), а также обезвоженные продукты (яичный порошок, молочный порошок, порошковые супы, быстрорастворимые дессерты, какао и т.д.) после предварительного размельчения и разведения проб стерильной водой в соотношении 1:1 или 1:10;

I. Метод полуавтоматического ШТРИХОВОГО ПОСЕВА

применяется при исследовании пищевых (в т.ч. молочных) продуктов с предполагаемым высоким содержанием микроорганизмов.

1
Установить НоваСтрик вертикально на ровной поверхности. Одной рукой удерживая пробирку, отвинтить другой рукой крышку и быстрым движением вытащить лопасть, манипуляцию посева можно производить, удерживая НоваСтрик в руке.
2
Удерживая лопасть строго вертикально, погрузить зубцы на несколько секунд, приблизительно до половины их длины, в контейнер с пробой, без предварительного её разведения для жидких продуктов; для сухих продуктов пробу предварительно развести стерильной дистиллированной водой в соотношении 1:10 или 1:1.
  Ограничения: НЕ ПРИКАСАТЬСЯ РУКАМИ К ВНУТРЕННИМ СТЕРИЛЬНЫМ ЭЛЕМЕНТАМ ЛОПАСТИ И ПЛАСТИКОВОГО КОЛЬЦА!
3
Вставить зубцы лопасти в отверстие исходной пробирки НоваСтрика, а затем быстрым, вертикальным и продолжительным усилием (шлепком ладони или ударом пальца) втолкнуть лопатку в пробирку и закрутить крышку.
4
Инкубировать НоваСтрик при температуре (37+1)°С в течение 18-20 часов, предварительно открутив крышку на полоборота.
5
Определить наличие и характер колоний. Определить концентрацию микроорганизмов в милилитре пробы, сравнивая плотность проросших колоний на каждой стороне агара с приложенным к упаковке НоваСтрика BD-521 графиком плотности роста колоний методом полуавтоматического ШТРИХОВОГО ПОСЕВА. При необходимости следует умножить результат на фактор разведения пробы.

Пример 1 : Посев произведен без разведения пробы, выросло на одной агаровой поверхности 20 колоний - концентрацию микроорганизмов в 1 мл определяем с помощью графика плотности роста колоний методом полуавтоматического ШТРИХОВОГО ПОСЕВА - на оси абсцисс находим количество колоний (20), проводим линию до пересечения с графиком, опускаем перпендикуляр на ось ординат, получаем результат - 6x103 КОЕ в мл.

Пример 2 : Посев произведен из разведения 1:10, выросло на агаровой поверхности 20 колоний, с помощью Графика плотности роста колоний методом полуавтоматического ШТРИХОВОГО ПОСЕВА находим концентрацию КОЕ, результат умножаем на 10 -6,0х103х 10 = 6х104).

II. Метод ПОГРУЖЕНИЯ СЛАЙДА в пробу

применяется при исследовании пищевых (в т.ч. молочных) продуктов с предполагаемым низким содержанием микроорганизмов или при посеве из накопительной среды.
1
Отвинтить крышку НоваСтрика и быстрым движением извлечь лопатку.
2
Немедленно вставить зубцы лопатки в отверстие исходной пробирки НоваСтрика, а затем быстрым, вертикальным и продолжительным усилием (шлепком ладони или ударом пальца) втолкнуть лопатку в пробирку (для того, чтобы установить зубцы в верхнюю позицию).
3
Извлечь лопатку вновь и, удерживая строго вертикально, погрузить ее на несколько секунд в пробу или контейнер с засеянной накопительной средой до полного покрытия агара. Разрешается облить пробой поочередно две стороны лопасти , до полного покрытия агаров.
4
Извлечь лопатку из контейнера, стряхнуть избыток пробы в контейнер, вставить лопатку в пробирку и закрутить крышку.
5
Перед помещением в инкубатор открутить крышку на полоборота, инкубировать засеянный НоваСтрик при температуре (37±1) °С в течение 18-20 часов.
6
Определить наличие и характер колоний. Определить концентрацию микроорганизмов в милилитре пробы, сравнивая плотность проросших колоний на каждой стороне агара с приложенным к упаковке НоваСтрика Графиком плотности роста колоний методом погружения слайда в пробу, при необходимости умножив результат на фактор разведения пробы.
Пример 1: произведен посев без разведения пробы, выросло 20 колоний, концентрацию микроорганизмов в 1 мл определяем с помощью Графика плотности роста колоний методом погружения слайда в пробу - на оси абсцисс находим количество колоний (20), проводим линию до пересечения с графиком, опускаем перпендикуляр на ось ординат, получаем результат - 2,Ох.1О3 КОЕ в 1 мл).

III. КОНТАКТНЫЙ метод

применяется при исследовании следующих материалов:

Смывы с рабочих поверхностей, кожных покровов рук, спецодежда

оборудование и др.

1 Отвинтить крышку НоваСтрика и быстрым движением вытащить лопатку.
2
Немедленно вставить зубцы лопатки в отверстие исходной пробирки НоваСтрика, а затем быстрым, вертикальным и продолжительным усилием (шлепком ладони или ударом пальца) втолкнуть лопатку в пробирку (для того, чтобы установить зубцы в верхнюю
позицию).
3
Извлечь лопатку вновь и удерживая рукой за крышку, легким усилием прижать лопатку одной стороной агара к исследуемой поверхности в течение нескольких секунд. Перевернуть лопатку и повторить манипуляцию со второй стороной НоваСтрика.
  Ограничения: НЕ ПРИКАСАТЬСЯ РУКАМИ К ВНУТРЕННИМ СТЕРИЛЬНЫМ ЭЛЕМЕНТАМ ЛОПАТКИ!
4 Вставить лопатку в пробирку и ввернуть крышку.
5
Отправить засеянный НоваСтрик с прикрепленным к нему направлением на анализ , в лабораторию для последующей инкубации и дальнейшего исследования. В случае затруднений в немедленной отправке засеянного НоваСтрика в лабораторию, разрешается хранить его в плотно закрытом состоянии, при комнатной температуре до 48 часов.
  Ограничения: НЕ ПОМЕЩАТЬ ЗАСЕЯННЫЙ НОВАСТРИК В ХОЛОДИЛЬНИК!
6 При поступлении в лабораторию, инкубировать НоваСтрик в вертикальном положении (предварительно открутив крышку на полоборота) при температуре (37±1)°С в течение 18-20 часов.
7
Определить концентрацию микроорганизмов в миллилитре пробы сравнивая плотность проросших колоний на каждой стороне агара с приложенным к упаковке НоваСтрика Графиком плотности роста колоний при посеве КОНТАКТНЫМ методом.

9. Определение общего микробного числа и бактерий группы кишечной палочки (НоваСтрик BD - 507)

9.1 Рабочие среды:
  a)
РСА - питательная среда общего назначения, используемая для обнаружения и количественного учета обсеменения бактериями, дрожжевыми и плесневыми грибами.
  b)
VRBA - селективная питательная среда для обнаружения колиформных микроорганизмов в продуктах питания. Селективность среды обусловлена присутствием таких ингибиторов, как желчные соли и кристаллический фиолетовый. Дифференциация кишечной группы микроорганизмов достигается благодаря комбинации лактозы и индикатора нейтрального красного. Бесцветные или розово-красные колонии образуются в зависимости от способности микроорганизма ферментировать лактозу.
9.2
Чувствительность НоваСтрик позволяет определять загрязнение при концентрациях 10 мк/мл при посеве методом погружения слайда в пробу и 10 мк/мл при посеве штриховым методом. Время проведения анализа бактериального загрязнения проб (от посева до получения результата) не более 18-20 часов.
9.3 Общее микробное число
  Количество колониеобразующих единиц (КОЕ) мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в 1 г/мл продукта определяется штриховым методом посева на НоваСтрик (путем погружения засевающих зубцов в пробу без предварительного ее разведения (жидкие и полужидкие продукты), продукты твердой консистенции засевать после предварительного размельчения и разведения стерильной водой в соотношении 1:1 или 1:10).
9.4 Бактерии группы кишечной палочки.
       
Масса продукта, в которой не допускается Методика посева на НоваСтрик
Положительный результат
       
1
0,001
Посев производится методом штрихового посева.
Полное отсутствие колоний nacpeneVRBA
       
2
0,01
Посев производится методом погружения слайда в пробу.
Полное отсутствие колоний HacpefleVRBA
       
3
0,1
Посев производится пипеткой, нанести на поверхность агара 0,1 мл образца.
Полное отсутствие колоний на cpefleVRBA
   

БГКП - не допускаются в 1,0 мл/г и более - требуемое количество исследуемого продукта поместить в накопительную среду (Кесс-лера) и, после инкубации 18-24 часа, произвести посев на НоваСтрик методом погружения агаровой пластинки в пробу (либо смочить поверхность агаровой пластинки другим способом - облить, нанести пипеткой).

Учет результатов:

a) НоваСтрик BD - 507 через 18-20 часов инкубации при температуре (37±1)°С обеспечивает:
  • на светло-желтой агаровой пластине (Plat Count Agar) рост энтеробактерий в виде бесцветных, полупрозрачных, плоских колоний и стафилококков в виде белых, выпуклых, круглых колоний.
  • на красновато-фиолетовой агаровой пластине (Violet Red Bile Agar) рост энтеробактерий с четкой дифференциацией шигелл от эшерихий и подавлением роста стафилококков и грибов. Рост лактозоотрицательных энтеробактерий наблюдается в виде блестящих, круглых, бесцветных колоний, лактозоположительных - в виде блестящих, круглых колоний от розового до красного цвета.

10. Обнаружение, количественный учет БГКП и стафилококкового обсеменения. (НоваСтрик BD - 508)

10.1 Рабочие среды:
  a) Baird Parker Agar - селективная питательная среда для обнаружения и количественного учета обсеменения золотистым стафилококком продуктов питания. Эта среда может быть также использована для идентификации стафилококков на основе их лецитиназной активности. Соль пировиноградной кислоты инкорпорируется золотистым стафилококком, обеспечивая его колониям черную окраску. Глицин и соли лития служат ингибиторами роста энтеробактерий и грибов.
  b) VRBA - селективная питательная среда для обнаружения колиформных микроорганизмов в продуктах питания.
10.2
НоваСтрик BD - 508 как метод индикации возможного присутствия возбудителя основан на обнаружении и идентификации бактерий группы кишечной палочки и S. aureus.
10.3 Staphylococcus aureus
   
       
Масса продукта, в которой не допускается Методика посева на НоваСтрик
Положительный результат
       
1
0,001
Посев производится методом штрихового посева.
Полное отсутствие колоний на средеВакс! Parker Agar
       
2
0,01
Посев производится методом погружения слайда в пробу.
Полное отсутствие колоний на cpefleBaird Parker Agar
       
3
0,1
Посев производится пипеткой, нанести на поверхность агара 0,1 мл образца.
Полное отсутствие колоний на средеВаЫ Parker Agar
   

Staphylococcus aureus - не допускается в 1,0 мл/г и более - требуемое количество исследуемого продукта поместить в накопительную среду (солевой бульон) и, после инкубации 18-24 часа, произвести посев на НоваСтрик методом погружения агаровой пластинки в пробу (либо смочить поверхность агаровой пластинки другим способом - облить, нанести пипеткой).

10.4 Техника посева на питательную среду VRBA описана в предыдущей главе.
10.5 Ожидаемые результаты:
  НоваСтрик BD - 508 через 18 - 20 часов инкубации при температуре (37+1 )°С обеспечивает:
 
  • на ярко-желтой агаровой пластине (Baird Parker Agar) рост коагулазоположительных стафилококков в виде блестящих, выпуклых, черных или серовато-черных колоний с ореолом или без него.
  • на красновато-фиолетовой агаровой пластине (Violet Red Bile Agar) рост энтеробактерий с четкой дифференциацией шигелл от эшерихий и подавлением роста стафилококков и грибов. Рост лактозоотрицательных энтеробактерий наблюдается в виде блестящих, круглых, бесцветных колоний, лактозоположительных - в виде блестящих, круглых колоний от розового до красного цвета.

11. Обнаружение и идентификация кишечных патогенов. Дифференциация шигелл и сальмонелл. (НоваСтрик BD - 521)

11.1 Рабочие среды:
  a) Salmonella ID Agar : представляет собой селективную питательную среду для обнаружения и прямой идентификации сальмонелл.
  b)
XLD Agar : предназначен для обнаружения и идентификации кишечных патогенов, особенно шигелл. Дифференциация шигелл и сальмонелл основывается на трех реакциях: ферментации ксилозы, декарбоксилации лизина и продукции сероводорода.
  c) Накопительная среда - стандартная магниевая среда.

Магниевую среду готовят путем соединения трех растворов:

Приготовление раствора 1: 8,4 г. пептона, 14,3 г. хлористого натрия, 40 см3 дрожжевого экстракта, приготовленного по ГОСТ 10144.1, 2,85 г. однозамещенного фосфорно-кислого калия растворяют при нагревании в 1780 см3 дисцилированной водой.

Приготовление раствора 2: 71,4 г. хлористого магния (MgC12 • 6Н2О) растворяют при нагревании в 180 см3 дисцилированной воды.

Приготовление раствора 3: берут 1,8 см3 0,5% водного раствора бриллиантового зеленого.

Приготовленные растворы соединяют, устанавливают рН так, чтобы он после стерилизации составлял при температуре 25°С 7,2±0,2, разливают в колбы или флаконы по 100 см3 и стерилизуют при температуре (112±1) °С в течении 30 мин.

11.2
Требуемое количество продукта (25 мл/г) поместить в накопительную среду и, после инкубации в течение 18-24 часов , произвести посев на НоваСтрик методом погружения агаровой пластинки в пробу. Засеянный НоваСтрик инкубировать при температуре (37±1)°С 18-20ч.
11.3 Учет результатов:
НоваСтрик BD - 521 через 18-20 часов инкубации при температуре (37+1 )°С обеспечивает:
  • на оранжевой агаровой пластине (Xylose Lysine Decarboxylase Agar) рост кишечной палочки и других непатогенных колиформов может быть частично подавлен или проявляться в виде больших плоских желтых колоний. Шигеллы образуют красные колонии. В зависимости от способности продуцировать сероводород, рост сальмонелл проявляется в виде красных колоний (не продуцирующие сероводород) или красных колоний с черным центром (продуцирующие сероводород).
  • на желтой агаровой пластине (Salmonella ID Agar) рост сальмонелл наблюдается в виде зелёных колоний, шигелл - в виде бесцветных колоний, а рост кишечной палочки и других непатогенных колиформов проявляется в виде черных колоний.
   
Микроорганизм
Xylose Lisine Desoxycholate Agar Цвет агара: оранжевый
Salmonella ID Agar Цвет агара: желтый
     
Е. coli, колиформы
Частичный рост, желтые колонии
Черные колонии
Proteus spp.
Черные колонии
Черные колонии
Salmonella spp.
Прозрачные колонии с черным центром
Зеленые колонии
Shigella spp.
Красные колонии
Черные колонии
S. aureus
Heт роста
Heт роста
Hosted by uCoz